血清藥理學(xué)方法觀察復(fù)方斑蝥膠囊對(duì) 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響
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血清藥理學(xué)方法觀察復(fù)方斑蝥膠囊對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響
楊軍 ，丁敏 ，張?zhí)?，宋自閬，曹永艷
摘要
目的：研究復(fù)方斑蝥膠囊含藥動(dòng)物血清對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC一7721增殖的影響。方法：采用血清藥理學(xué)方法，對(duì)兔灌胃給予不同劑量(臨床等效劑量、2倍臨床等效劑量和3倍臨床等效劑量)的復(fù)方斑蝥膠囊混懸液，應(yīng)用MTT比色法觀察含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC一7721增殖的抑制作用，同時(shí)觀察臨床等效劑量組各采血時(shí)間點(diǎn)的抑制作用。結(jié)果：3個(gè)劑量組的含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0．01)，其中以3倍臨床等效劑量組合藥血清的抑制率最高；臨床等效劑量組各采血時(shí)間點(diǎn)的含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0．05)，其中3h時(shí)含藥血清的抑制率最高。結(jié)論：復(fù)方斑蝥膠囊含藥動(dòng)物血清對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMc一7721增殖具有一定的抑制作用，并具有劑量依賴(lài)性。
關(guān)鍵詞 復(fù)方斑蝥膠囊；人肝癌細(xì)胞SMMC一7721；血清藥理學(xué)復(fù)方斑蝥膠囊(FBC)的主要成分有斑蝥、熊膽粉、人參等，臨床上主要用于治療癌癥，尤其是對(duì)原發(fā)性肝癌，顯示了較好的療效。該藥殺滅肝癌細(xì)胞的機(jī)制在國(guó)內(nèi)、外還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，為此，筆者采用血清藥理學(xué)方法觀察家兔灌胃給予復(fù)方斑蝥膠囊后其含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC一7721增殖的影響，以為復(fù)方斑蝥膠囊治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1．1 動(dòng)物與試藥
新西蘭大耳白兔15只，體重(2．5±0．2)kg，雌雄不限，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)20020001。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Amresco公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO公司)；FBC。
1．2 細(xì)胞
人肝癌細(xì)胞SMMC一7721由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室惠贈(zèng)。處理方法：將細(xì)胞株培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃ 培養(yǎng)箱中，在5％CO 、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d～3d后以0．1％胰酶消化傳代。
1．3 最佳采血時(shí)間點(diǎn)的確定
取兔3只，體重(2．5±0．1)kg，雌雄不限。以FBC內(nèi)容物臨床等效劑量加入磷酸鹽緩沖液(PBS)制成混懸液后灌胃給藥，1次／d，連續(xù)3d，末次給藥后1、2、3、4、5h自耳緣靜脈采血，分離血清，56℃滅活30min，O．22um濾膜過(guò)濾，除菌，-20~C保存，備用。對(duì)照血清于給藥前采血制備，方法同含藥血清。將各兔相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)含藥血清等量混合。以各采血時(shí)間點(diǎn)的含藥血清進(jìn)行MTT試驗(yàn)。以確定最佳采血時(shí)間點(diǎn)。
1．4 分組及中藥懸液制備
將兔分為臨床等效劑量組(n=6)、2倍臨床等效劑量組(n=3)和3倍臨床等效劑量組(n=3)。臨床等效劑量組的給藥劑量=臨床用量×等效劑量系數(shù)(按體表面積計(jì)算)×培養(yǎng)體系血清稀釋度 。動(dòng)物體表面積和體重之間的關(guān)系通用公式：lgS=0．8 762+0．698lgW。式中S為體表面積(cm)，W 為體重(g)，人標(biāo)準(zhǔn)體重按70kg計(jì)算 。復(fù)方斑蝥膠囊的臨床用量為1500mg／d，等效劑量系數(shù)=S兔/ S人，培養(yǎng)體系血清稀釋度為1O。以適量PBS將FBC內(nèi)容物制成混懸液。其它劑量組按相應(yīng)倍數(shù)加倍。將上述3組兔灌胃給予相應(yīng)藥物后(1次／d，連續(xù)3d)，于末次給藥后3h自耳靜脈取血，分離血清，制作含藥兔血清；將給藥前的兔(n=3)以同樣方法分離血清作為對(duì)照兔血清組。另制備空白對(duì)照組(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)和細(xì)胞對(duì)照組(不加兔血清，作為各處理組各濃度水平的共同對(duì)照)。
1．5 MTT試驗(yàn)
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌細(xì)胞SMMC一7721，消化，以PBS洗滌2次。離心，棄去上清液，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成濃度為1．5×104 個(gè)／ml的細(xì)胞懸液。將此細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔接種180ul，培養(yǎng)24h后加入相應(yīng)對(duì)照兔血清或含藥兔血清20u1，細(xì)胞對(duì)照組加入ul PBS，每孔設(shè)8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后小心吸出培養(yǎng)液，換以l80 ul不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液和20ulMTT，置于5％C02、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去培養(yǎng)液，加入200 ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)為570nm。
抑制率=(對(duì)照血清組A值一實(shí)驗(yàn)血清組A值)／對(duì)照血清組A值。
1．6 劑量一反應(yīng)曲線
取兔12只，體重(2．5±0．1)kg，雌雄不限，分為臨床等效劑量組、2倍臨床等效劑量組、3倍臨床等效劑量組和對(duì)照組，每組3只。各組以相應(yīng)劑量FBC內(nèi)容物懸液對(duì)兔灌胃給藥，1次／d，連續(xù)3d，于末次給藥后最佳采血時(shí)間點(diǎn)采血，分離血清，56℃滅活30min，0．22um濾膜過(guò)濾，除菌，-20℃保存，備用。對(duì)照組除以等體積PBS灌胃外，其余操作均同含藥組。將各組內(nèi)3只兔的血清等量混合，進(jìn)行MTT試驗(yàn)，繪制劑量---反應(yīng)曲線。
1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
結(jié)果以 EQ 開(kāi)關(guān)參數(shù) x(_)±S表示，并進(jìn)行方差分析和SNK(Student—Newman—Keuls)檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2．1 不同采血時(shí)間點(diǎn)血清MTT試驗(yàn)結(jié)果以臨床等效劑量組不同采血時(shí)間點(diǎn)含藥血清進(jìn)行MTT試驗(yàn)，結(jié)果詳見(jiàn)表1和圖1。
表1 不同采血時(shí)間點(diǎn)MTT試驗(yàn)結(jié)果(A，x(_) ±s)
Tab 1 Results of M TT assay with drug sera collected
atdifferent hours(A,x(_)±s)
|
細(xì)胞對(duì)照組 |
對(duì)照血清組 |
FBC臨床等效劑量組 |
||||
|
1 h |
2h |
3h |
4h |
5h |
||
|
1.138± 0．072 |
l.135± 0．086▲ |
0.950± 0.174* |
0.915± 0. O95* |
0.820±0.100*Δ |
0.896±0.072* |
1.109±0.098# |
與細(xì)胞對(duì)照組比較：▲P>0．05；與對(duì)照血清組比較：*P<0．Ol，#P<0．05；與5h時(shí)間點(diǎn)比較：△P<0．05
Compared with the cellular control group：▲P >0．05；comparedwith the rabbit serum group：*P <0．01，#P<0．05；compared with the serum at 5hr：△P <0．05
圖1 不同采血時(shí)間點(diǎn)對(duì)人肝癌SMMC一7721細(xì)胞增殖的抑制率曲線
Fig 1 Inhibitory rate curves on SM MC 。。7721 cells proliferation
with drugs sera collected at different hours inclinical equivalent dose group
由表1可見(jiàn)，對(duì)照血清組與細(xì)胞對(duì)照組比較，吸光度無(wú)顯著性差異(P>0．05)，說(shuō)明未含藥的對(duì)照血清對(duì)人肝癌SMMC一7721細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用。
由圖1可見(jiàn)，各取血時(shí)間點(diǎn)的含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖均有抑制作用。5h時(shí)吸光度與對(duì)照組吸光度比較具有顯著性差異(P<0．05)，其余各時(shí)間點(diǎn)吸光度與對(duì)照組吸光度比較具有極顯著性差異(P<0．01)；3h時(shí)間點(diǎn)的吸光度與5h時(shí)間點(diǎn)的吸光度比較具有顯著性差異(P <0．05)；其它各時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較無(wú)顯著性差異(P>0．05)。1h～5h時(shí)間點(diǎn)含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖抑制率由低到高再到低，在3h處達(dá)到峰值，因此最佳采血時(shí)間點(diǎn)確定為給藥后3h。
2．2 不同劑量組血清MTT試驗(yàn)結(jié)果
以各劑量組含藥血清進(jìn)行MTT試驗(yàn)，結(jié)果詳見(jiàn)表2和圖2。
表2 不同劑量組MTT試驗(yàn)結(jié)果(A, x(_)±s)
Tab 2 Results of M TT assay with drug sera in different
dose groups(A, x(_)±s)
|
細(xì)胞對(duì)照組 |
對(duì)照血清組 |
FBC等效劑量組 |
FBC2倍等效劑量組 |
FBC3倍等效劑量組 |
|
1.136±0.082 |
1.132±0.068 |
0.800±0.080 |
0.735±0.058 |
0.658±0.135 |
與細(xì)胞對(duì)照組比較：▲p>0．05；與對(duì)照血清組比較：* P<0．01；與等效劑量組比較：△P<0．01
compared with the cellular control group：▲p > 0．05；comparedwith the rabbit serum group：*P<0．01；compared with the clinicalequivalent group：△P< 0．01
圖2 不同劑量組對(duì)人肝癌SMMC一7721細(xì)胞增殖的抑制率曲線
Fig 2 Inhibitory rate curves on SM MC 。。7721 cells proliferationwith drug sera collected in different dose groups
由表2和圖2可見(jiàn)，對(duì)照血清組與細(xì)胞對(duì)照組比較，吸光度無(wú)顯著性差異(P>0．05)，說(shuō)明對(duì)照血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用。FBC各劑量組血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖均有抑制作用，吸光度與對(duì)照組比較有極顯著性差異(P<0．01)。其中，3倍等效劑量組與等效劑量組比較，吸光度具有極顯著性差異(P<0．01)。提示含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖存在著劑量依賴(lài)性抑制作用。
3 討論
傳統(tǒng)的中藥藥理體外實(shí)驗(yàn)是將未精制提取的中藥或中藥復(fù)方粗制劑直接加入離體反應(yīng)體系(細(xì)胞培養(yǎng)、酶反應(yīng))中進(jìn)行的，難以獲得與體內(nèi)藥物作用相同的結(jié)果。日本學(xué)者“在20世紀(jì)80年代提出血清藥理學(xué)的概念，即給動(dòng)物灌服受試藥物，在一定的時(shí)間里，取其血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。已有眾多研究表明，采用血清藥理學(xué)方法研究復(fù)方中藥的藥理作用具有一定的科學(xué)性和合理性。血清藥理學(xué)理想的采血時(shí)間應(yīng)為血藥濃度達(dá)到峰值左右的時(shí)間，這樣能夠避免因有效物質(zhì)尚未吸收或代謝完全而造成的假陰性結(jié)果。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，不同研究中的最佳采血時(shí)間應(yīng)當(dāng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。筆者通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)的含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞抑制率的結(jié)果，確定以末次給藥后3h為最佳采血時(shí)間點(diǎn)。在應(yīng)用血清藥理學(xué)研究復(fù)方中藥的藥理作用過(guò)程中，由于加入反應(yīng)系統(tǒng)的血清需經(jīng)稀釋后使用，故應(yīng)盡可能增大給藥劑量。但給藥劑量加倍后，血藥濃度卻不可能也增加相應(yīng)倍數(shù)，因?yàn)檠帩舛扰c給藥劑量并不成等比增加，同時(shí)還要受到灌胃藥物濃度和體積的限制。鑒于此，筆者在本研究中采用王力倩等提出的參考公式確定了給藥劑量，并且在此基礎(chǔ)上增加了2個(gè)劑量組。結(jié)果表明，復(fù)方斑蝥膠囊含藥血清對(duì)SMMC一7721細(xì)胞增殖存在劑量依賴(lài)性抑制作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，筆者確定了制備復(fù)方斑蝥膠囊含藥血清的最佳采血時(shí)間和給藥劑量，為以后應(yīng)用血清藥理學(xué)的方法研究復(fù)方斑蝥膠囊的分子藥理學(xué)作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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